Во процесот на спроведување генетски студии, често се среќаваме со недоволни примероци на РНК, на пример, за проучување на ситни анатомски орални тумори, дури и примероци од едноклеточни примероци, како и примероци од специфични генски мутации кои се транскрибираат на многу ниски нивоа во човечките клетки.Секако, за тестот за КОВИД-19, доколку брисевите не се на вистинското место или не се доволно пати за време на земање мостри, големината на примерокот ќе биде многу мала, поради што пред два дена излезе и Комисијата за здравство и планирање на семејството и го поминал тестот, и ако семплерот на нуклеинска киселина не зел шест примероци, можете да го пријавите.
Чувствителноста на реагенсот е важна затоа што го имаме овој или оној проблем, па што можеме да направиме за да ја подобриме чувствителноста на RT-PCR?
Пред да разговараме за можните решенија, да споменеме две големи компликации со ситуацијата што штотуку ја спомнавме.
Пред сè, се грижиме за загубата на РНК кога имаме само неколку клеточни популации во нашиот примерок.Доколку се користат традиционални методи за одвојување и чистење, како што е методот на колона или методот на таложење на нуклеинска киселина, постои голема можност неколкуте примероци да се изгубат.Едно решение е да се додаде молекула носител, како што е tRNA, но дури и тогаш, не постои гаранција дека нашиот експеримент за обновување е во ред.
Значи, што е подобар начин?Добра опција за култивирани клетки или микроанатомски примероци е да се користи директна лиза.
Идејата е да се поделат клетките за 5 минути, да се ослободи РНК во растворот, потоа да се запре реакцијата на 2 минути, потоа да се додаде лизатот директно во реакцијата на обратна транскрипција за да не се изгуби РНК и на крајот директно да се стави добиената cDNA. во реакцијата во реално време.
Но, што ако, поради ограничена почетна точка или мала количина на целен генски израз, можеме да ја рециклираме целата РНК и сепак да не обезбедиме доволно шаблони за да добиеме добар сигнал во реално време?
Во овој случај, чекорот пред-засилување може да биде многу корисен.
Следното е шема за зголемување на чувствителноста по обратна транскрипција.Пред да започнеме, треба да прашаме низводно за кои цели сме заинтересирани, за да дизајнираме специфични прајмери за овие цели за предзасилување.
Ова може да се постигне со создавање мешан прајмер со најмногу 100 пара прајмери и реакциски циклус од 10 до 14 пати.Затоа, потребен е главен микс специјално дизајниран за ова барање за претходно да се засили добиената cDNA.
Причината за поставување на бројот на циклуси помеѓу 10 и 14 е тоа што овој ограничен број циклуси обезбедува случајност помеѓу различните цели, што е од клучно значење за истражувачите на кои им се потребни квантитативни молекуларни информации.
По претходно засилување, можеме да добиеме големо количество cDNA, така што чувствителноста на откривање на задниот дел е значително подобрена, а можеме дури и да го разредуваме примерокот и да извршиме повеќе PCR реакции во реално време за да ги елиминираме можните случајни грешки.
Време на објавување: април-11-2023 година